Резюме проекта, выполняемого/выполненного

в рамках ФЦП

«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы»

по этапу № 2

Номер Соглашения о предоставлении субсидии: 14.607.21.0065

Тема: «Разработка тест-системы для выявления и анализа лекарственной устойчивости инфекционных агентов, приводящих к нарушениям репродуктивных функций»

Приоритетное направление: Науки о жизни

Критическая технология: Геномные, протеомные и постгеномные технологии

Период выполнения: 23.09.2014 - 30.12.2016

Плановое финансирование проекта: 108.125 млн. руб.

Бюджетные средства        86.50 млн. руб.,

Внебюджетные средства  21.625 млн. руб.

Получатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Индустриальный партнер: Общество с ограниченной ответственностью "БИОЧИП-ИМБ"

Ключевые слова: Тест-система для диагностики in vitro, инфекционные агенты, заболевания урогенитального тракта, нарушение репродуктивных функций человека, генетические детерминанты лекарственной устойчивости, молекулярно-генетический метод, мультиплексный анализ нуклеотидных последовательностей, ДНК-чипы

1. Цель проекта

Для диагностики и выбора оптимальной стратегии лечения заболеваний, приводящих к нарушениям репродуктивных функций человека, существует необходимость одновременной идентификации вызывающих заболевания микроорганизмов и определение их чувствительности к антимикробным препаратам. В настоящее время в России комплексные подходы к клинико-лабораторной диагностике возбудителей отсутствуют. Оптимальной платформой создания тест-систем для многопараметрического анализа является технология ДНК-чипов.

Целью проекта является разработка тест-системы для одновременной идентификации основных клинически значимых возбудителей инфекций, приводящих к нарушениям репродуктивных функций (ИПНРФ) с одновременным определением генов и мутаций, ответственных за устойчивость к широкому спектру антимикробных препаратов (АМП), включая ципрофлоксацин, пенициллин, спектиномицин, цефтриаксон, доксициклин, метронидазол, азитромицин, тетрациклин.

2. Основные результаты проекта

Осуществлен сбор и обработка клинического материала для получения чистых культур возбудителей ИПНРФ, включая T. pallidum, N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, M. hominis, G. vaginalis, U. urealiticum parvum, U. urealiticum T960, A. vaginae, E. fecalis, T. vaginalis, E. coli, M. mulieris, S. anginosus, F. nucleatum, S. epidermidis, B. fragilis. Дополнена коллекция высокоочищенных препаратов ДНК возбудителей ИПНРФ, выделенных из клинического материала, насчитывающая, суммарно 200 образцов. Проведено таргетное секвенирование геномов возбудителей (всего – 10203 сиквенса), с целью идентификации генетических детерминант устойчивости к АМП.

На основе анализа нуклеотидных последовательностей возбудителей ИПНРФ и результатов таргетного секвенирования культур возбудителей, устойчивых и чувствительных к АМП сконструированы и синтезированы специальные реагенты (олигонуклеотиды для иммобилизации на ДНК-чипе и праймеры для амплификации) для идентификации 17 возбудителей ИПНРФ (СР-1, всего – 65 ед.) и специальные реагенты для идентификации генетических детерминант устойчивости к АМП (СР-2, всего – 176 ед).

Разработаны и изготовлены ДНК-чипы – массивы гидрогелевых элементов объемом менее 0,1 нл, содержащие иммобилизованные олигонуклеотиды, обеспечивающие идентификацию возбудителей ИПНРФ или анализ их генетических детерминант устойчивости к АМП. Иммобилизованные в ячейках ДНК-чипа олигонуклеотиды включают репортерную метку для внутреннего флуоресцентного контроля (нормировки) при анализе результатов гибридизации на ДНК-чипе, что позволяет повысить чувствительность и воспроизводимость анализа.

Проведены испытания СР-1 (на этапе 1), СР-2 (на этапе 2) с использованием разработанных ДНК-чипов, синтетических фрагментов и образцов ДНК, выделенных из клинического материала и культур возбудителей ИПНРФ. По результатам испытаний при пятикратном анализе каждого образца определены диагностические характеристики СР-1 и СР-2, составившие:

- чувствительность (СР-1) – 96,8% (более 95%); - специфичность (СР-1) – 99,4% (более 95%);

- чувствительность (СР-2) – 91,94% (более 90%); - специфичность (СР-1) – 97,80% (более 90%);

Полученные значения удовлетворяют требованиям технического задания Соглашения, что позволило, по результатам испытаний, сформировать полный комплект олигонуклеотидов и праймеров, которые будут использованы для разработки тест-системы для одновременной идентификации и анализа лекарственной устойчивости возбудителей ИПНРФ. Составлены спецификации СР-1 и СР-2.

За счет внебюджетных средств закуплено масс-спектрометрическое оборудование, позволившее провести характеризацию клинического материала с целью идентификации бактериального состава для формирования коллекции образцов ДНК исследуемых возбудителей ИПНРФ.

Индустриальным партнером проекта - ООО «БИОЧИП-ИМБ» получены высокоочищенные препараты ДНК для каждого из возбудителей ИПНРФ для последующего таргетного секвенирования, проведена верификация качества синтезированных специальных реагентов и синтетических фрагментов ДНК, осуществлен контроль качества подложек изготовленных ДНК-чипов.

Результаты проекта в части разработки и испытаний специальных реагентов, ДНК-чипов, уникальной коллекции возбудителей ИПНРФ сопоставимы с работами мирового уровня.

Полученные результаты полностью соответствуют требованиям к выполняемому проекту. Соответствие специальных реагентов для идентификации возбудителей требованиям ТЗ отражено в Протоколах и Актах испытаний, проведенных согласно разработанным Программам и Методикам испытаний.

3. Охраноспособные результаты интеллектуальной деятельности (РИД), полученные в рамках прикладного научного исследования и экспериментальной разработки

Оформление и подача патентных заявок на охраноспособные результаты интеллектуальной деятельности планируется на последующих этапах.

4. Назначение и область применения результатов проекта

Разрабатываемая тест-система ориентирована на применение в практическом здравоохранении. Основными потребителями будут являться клинико-диагностические лаборатории учреждений дерматовенерологического профиля РФ, включая сеть кожно-венерологических диспансеров РФ, центры акушерства и гинекологии, родильные дома, урологические центры Министерства здравоохранения РФ, государственные и частные лаборатории, выполняющие анализы in vitro.

5. Эффекты от внедрения результатов проекта

Создание тест-системы позволит реализовать персонализированную терапию больных, основанную на рациональном назначении химиопрепаратов, значительно уменьшить количество осложнений терапии заболеваний, обусловленных микроорганизмами, устойчивыми к антимикробным препаратам.

6. Формы и объемы коммерциализации результатов проекта

Выпуск тест-системы будет осуществляться на производственных мощностях индустриального партнера – ООО «БИОЧИП-ИМБ», способной обеспечить изготовление ДНК-чипов на 10 млн. анализов/год. Первичный рынок коммерциализации будет включать лаборатории учреждений дерматовенерологического профиля РФ.

7. Наличие соисполнителей

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН): с 26.09.2014 г. по 30.12.2016 г.